限制性內切酶

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什麼是限制性內切酶？

限制性內切酶是用於合成重組DNA的生物工具之一。限制性內切酶是從細菌中分離出來的蛋白質。它們識別一個短的、特定的核苷酸序列，並在該特定位點切割DNA，該位點稱為限制性位點。當它們識別DNA中的任何特定核苷酸序列時，它們就會水解相鄰核苷酸之間的鍵並切割DNA分子。限制性內切酶通常被稱為限制性內切核酸酶，因為它們切割DNA鏈內部。

限制性內切酶的型別

它們分為三種類型：

• I型 - 這些是複雜的、多亞基酶。它們執行兩個功能：限制和修飾。它們在識別位點大約1000個鹼基對處切割DNA。因此，它們不用於重組DNA技術，並且由於它們不產生限制性片段，所以幾乎沒有實際價值。例如：EcoB, EcoK。

• II型 - 這些酶在其識別位點切割DNA，並可在體外用於生產重組分子。它們的識別位點約為4-8個鹼基對，並在未甲基化的位點引起切割。它們需要Mg²⁺作為它們的輔因子。目前，已知超過350種不同的II型限制性內切核酸酶具有100種不同的識別序列。例如：EcoRI, BamHI, HindIII。

• III型 - 它們是複雜的酶，兼具限制和甲基化（修飾）的特性。它們在其識別位點25-27個鹼基對處切割，因此它們不用於重組DNA技術。例如：EcoPI, HinfIII。

命名法

• 酶的名稱來源於分離它們的原核細胞的名稱。

• 屬的第一個字母成為酶名稱的第一個字母。它用大寫字母書寫。

• 物種名稱的前兩個字母構成酶名稱的第二和第三個字母。它們用小寫字母書寫。

• 所有這些字母都用斜體書寫。

• 酶名稱的第四個字母是菌株的第一個字母。它用大寫字母書寫。

• 從原核細胞的特定菌株中分離酶的順序由名稱末尾的羅馬數字表示。

工作機制

每個限制性內切核酸酶都會檢查DNA分子，尋找特定的識別序列。一旦找到識別序列，它就會結合到該位點，並透過水解磷酸二酯骨架在特定點切割DNA雙螺旋的每兩條鏈。

每個限制性核酸酶的限制性序列由DNA雙螺旋中一定數量的特定鹼基對組成。它被稱為迴文核苷酸序列。

限制性內切酶切割DNA鏈可以產生兩種型別的片段：具有粘性末端的片段和具有平末端的片段。

具有粘性末端的片段具有突出部分，因為一個片段比另一個片段長，而平末端在兩條鏈上都有直切。

研究限制性內切酶的重要性

限制性內切酶以高特異性切割鹼基對的能力使其在基因工程和分子生物學技術中的廣泛應用，使其成為重要的研究物件。

• 分子克隆 - 由於重組分子的合成，限制性內切酶具有極其重要的意義。它們用於切割目的基因和宿主DNA，以便它們可以結合在一起，從而形成重組DNA分子。

• DNA作圖 - 限制性內切酶用於確定DNA片段的結構資訊。它也稱為限制性作圖。

• 基因測序 - 限制性內切酶可用於透過消化大的DNA分子然後將其置於測序儀下進行測序。

• 限制性片段長度多型性 - 它涉及消化長DNA序列，然後根據其長度在凝膠電泳上分離它們。這些片段後來轉移到含有標記探針的膜上。

• 脈衝場凝膠電泳 - 它涉及分離大的DNA片段，並能夠區分不同菌株的細菌。

當前趨勢

研究人員進行DNA克隆實驗仍然經常採用的一種方法是限制性內切酶消化。如今，研究人員不僅依靠限制性內切酶進行體外實驗，還依靠它們進行幾乎任何涉及分析、操作和建立新的DNA序列組合的過程。目前，我們可以建立具有幾乎任何序列特異性的人工限制性內切酶。

結論

限制性內切酶是一種重要的生物工具，經常用於基因組學。它們用於在特定位點切割DNA分子，並在宿主基因組中建立一個空間以插入目的基因，從而建立重組DNA分子。

常見問題

Q1. 細菌如何對其自身的限制性內切酶具有免疫力？

A1. 細菌使用限制和修飾方法來保護自身的DNA免受限制性內切酶的作用。細菌透過向識別位點新增甲基基團來修飾其限制性位點。

Q2. 解釋載體。

A2. 載體包含外源DNA，它是一種將外源DNA轉運到宿主細胞的分子載體。載體包含限制性位點（新增DNA）和標記位點以識別轉化細胞。

Q3. 哪些因素會影響限制性內切酶的活性？

A3. 為了獲得適當的限制性內切酶活性，需要控制的因素包括：

• 星號活性 - 這是限制性內切酶活性的改變，在次優條件下，它們在非特異性位點切割。誘導甲基化DNA的因素：許多DNA分子在其識別位點添加了甲基基團，這使得它們更不容易被特定的限制性內切酶切割。

• 溫度 - 大多數內切核酸酶在37攝氏度下最佳工作。但有些內切核酸酶的最佳溫度可能低於25度或高於65度。

Q4. 什麼是迴文序列？

A4. 迴文是一組字母，無論正向還是反向閱讀都形成相同的單詞。類似地，DNA分子中的迴文核苷酸序列是指在兩條鏈上（5’到3’）讀取相同的鹼基對序列，它們位於相反的方向。

5’- GAATTC - 3’

3’- CTTAAG - 5’

Q5. 限制性作圖是什麼意思？

A5. 限制性作圖，也稱為基因作圖，用於透過將未知片段分解成碎片並識別斷點的位置來確定未知片段的序列。透過限制性內切酶分解片段後，它們透過凝膠電泳進行檢查，並根據其大小進行分離。