什麼是Cre-Lox重組？

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關鍵詞

基因操作，基因表達，Cre重組酶，識別位點，P1噬菌體，基因組，重組。

引言

Cre-Lox系統是體內進行基因操作的強大工具，因為它可以對基因表達進行出色的時空控制。這在使用動物模型時非常寶貴，因為不受控制的基因表達或完全的基因敲除可能是有害的或致命的。

顧名思義，Cre-Lox系統依賴於兩個元件才能發揮作用：Cre重組酶及其識別位點loxP。這些元件已從P1噬菌體中改造用於基因操作。LoxP位點是方向性的34 bp序列，由兩個13 bp識別位點組成，並由一個8 bp間隔區隔開。

這些序列除了P1噬菌體外，在任何已知的基因組中都不會自然出現，並且足夠長，因此不太可能偶然出現。因此，它們可以用於特定的基因操作，而不會產生意外的副作用。LoxP位點總是成對使用，通常位於基因或感興趣的區域或報告基因的兩側。loxP位點的方向將決定重組的結果。

Cre-Lox重組機制

首先，兩個Cre蛋白識別loxP位點並與其結合，形成二聚體。兩個Cre-loxP二聚體結合在一起形成四聚體，將兩個loxP位點以相反的方向結合在一起。最後，在loxP位點的中心發生dsDNA切割，併發生交叉事件。根據loxP位點的方向，重組可能產生三種結果

切除

如果lox位點以相同的方向位於某個序列的兩側，則重組將導致該序列的切除，將其從其原始基因座中刪除。此過程基本上是不可逆的。

倒位

如果lox位點以相反的方向位於某個序列的兩側，則重組將導致該序列的倒位。由於lox位點保持不變，因此此過程是可逆的，並且基因可以在兩種方向之間無限地“翻轉”。

易位

如果lox位點位於不同的DNA片段上，則重組將導致可逆的易位事件。lox側翼的DNA區域通常被稱為“floxed”。

DIO和DO開關

基因的反向版本將不會表達，因此可以使用DIO和DO載體來控制基因表達。DIO和DO載體在其感興趣的序列的兩側都帶有兩組不同的lox位點。這些序列可以組合起來構成DIO（雙側翼反向方向）或DO（雙側翼方向）開關。

DIO載體將具有以反向方向克隆的感興趣基因，並且在存在Cre的情況下將正確定向；因此，DIO載體是“Cre-On”。DO載體將具有以正確方向存在的感興趣基因，並在存在Cre的情況下發生倒位；因此，它們是“Cre-Off”。

應用

基本的Cre-loxP重組事件對於遺傳序列的切除最有用，因為該事件具有不可逆的特性。

Cre依賴性序列敲除

如果某個序列的兩側有兩個相同方向的loxP位點，則在存在Cre的情況下，該序列將被切除。這在進行基因編輯實驗時非常有用；可以使用選擇標記找到成功編輯的克隆，該標記可以使用Cre-Lox稍後去除。但是，對於研究必需基因來說，完全的基因敲除不是一個好選擇，因為這將導致致死表型。

Cre依賴性基因表達

可以在基因上游放置一個“lox-stop-lox”盒。在沒有Cre的情況下，終止盒會阻止基因的翻譯表達。在存在Cre的情況下，終止盒會被刪除，基因表達繼續進行。但是，使用“lox-stop-lox”方法控制基因表達有一些缺點。當Cre不存在時，此策略具有明顯的背景表達水平。此外，終止盒很大，這使得它們難以包裝到小的病毒中，例如腺相關病毒（AAV）。

高階應用

光遺傳學

DIO載體的一個特別流行的用途是光遺傳學實驗。視蛋白可以從注入小鼠大腦的DIO AAV表達。小鼠將從細胞型別特異性啟動子表達Cre，以便視蛋白僅在某些神經元中表達。當視蛋白在這些神經元中透過光啟用時，可以觀察到行為變化。

命運圖譜實驗

DIO開關也可用於命運圖譜實驗，用於確定某些祖細胞在生物體生長過程中如何複製。在後代細胞中，Cre表達對於報告基因表達不是必需的，因為Cre-On基因修飾是不可逆的且可遺傳的。

多個報告基因的共表達

DIO載體對於控制多個報告基因的共表達也非常有用。報告基因載體可以以高摩爾比共轉染，同時新增少量表達Cre的載體。這對於繪製某些細胞型別（例如神經元及其突觸）非常有用，這些細胞型別難以在高水平的報告基因表達下成像。

研究功能突變

將lox位點放置在不同的位置會導致一個基因的啟用和另一個基因的同時切除。該系統可用於輕鬆地用突變版本替換基因的野生型版本。這是一種研究必需基因的絕佳方法，因為傳統的敲除研究將是致命的。

結論

使用Cre-loxp系統的技術提供了研究基因功能的複雜性。最近，為了更精確地控制，Cre-loxp系統一直在不斷發展。此外，Cre-loxp系統方法一直在使用Crispr/Cas9技術和病毒系統不斷發展。

透過使用更復雜的控制技術，研究人員將能夠透過研究特定基因在所需時間（時間）和組織（空間）的功能來了解更精確的基因功能。有用的Cre相關入口網站和資料庫將透過允許研究人員查詢和獲取適合研究的Cre驅動品系來提高研究效率。