鳥槍法測序 - 概述

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關鍵詞

鳥槍法測序、全基因組測序、DNA 序列、鏈終止、片段化、測序、Sanger 測序。

簡介

鳥槍法測序是實現全基因組測序的關鍵技術之一。在遺傳學中，鳥槍法測序是一種用於確定生物體基因組DNA序列的實驗室技術。該方法涉及將基因組隨機分解成小的DNA片段，然後使用鏈終止法分別對這些片段進行測序。

透過進行幾輪片段化和測序，可以獲得目標DNA的多重重疊讀取。計算機程式查詢DNA序列中的重疊部分，利用它們以正確的順序重新組裝片段，以重建基因組。鳥槍法測序涉及將DNA序列隨機分解成許多小片段，然後透過查詢重疊區域來重新組裝序列。DNA被超聲處理以獲得所需大小的片段。

DNA測序的鏈終止法（“Sanger測序”）只能用於100到1000個鹼基對的短DNA鏈。由於此大小限制，較長的序列被細分為可以分別測序的較小片段，並且這些序列被組裝以給出總序列。

由於重複序列數量眾多，複雜基因組的組裝也變得更加複雜，這意味著類似的短讀取可能來自序列的完全不同部分。

全基因組鳥槍法測序

1979年首次提出了針對小型（4000-7000鹼基對）基因組的全基因組鳥槍法測序。第一個透過鳥槍法測序的基因組是菸草花葉病毒，發表在1981年。

配對末端測序

更廣泛的應用受益於配對末端測序，俗稱雙管鳥槍法測序。對同一片段的兩端進行測序並跟蹤配對資料比對兩個不同片段的一端進行測序更麻煩，但知道這兩個序列的方向相反，並且相距約一個片段的長度，這對於重建原始目標片段的序列很有價值。

方法

要應用此策略，將高分子量DNA鏈剪下成隨機片段，選擇大小，並克隆到合適的載體中。然後使用鏈終止法對克隆的兩端進行測序，產生兩個稱為末端讀取或讀取1和讀取2的短序列。

組裝

使用序列組裝軟體從讀取中重建原始序列。首先，將重疊的讀取收集到稱為重疊群的較長的複合序列中。根據間隙的大小，使用不同的技術來查詢間隙中的序列。如果間隙小（5-20kb），則使用聚合酶鏈式反應（PCR）進行測序。如果間隙大（>20kb），則透過細菌人工染色體（BAC）克隆大片段，然後進行測序。

覆蓋率

覆蓋率是讀取的平均數量。可以根據原始基因組的長度（G）、讀取的數量（N）和平均讀取長度（L）計算為N×L/G。在鳥槍法測序中需要高覆蓋率，因為它可以克服鹼基識別和組裝中的錯誤。DNA測序理論主題探討了此類數量的關係。

宏基因組鳥槍法測序

透過對環境樣本進行下一代測序獲得數百萬個讀取，可以全面瞭解任何具有數千種物種的複雜微生物組，例如腸道菌群。宏基因組測序的靈敏度使其成為臨床使用的有吸引力的選擇。但是，它強調了樣本或測序流程汙染的問題。

鳥槍法測序的優點

• 透過去除對映階段，全基因組鳥槍法測序比克隆到克隆測序快得多。

• 全基因組鳥槍法測序使用的DNA只是克隆到克隆測序所需的一小部分。

• 如果存在現有的參考序列，則全基因組鳥槍法測序特別有效。透過將其與現有的參考基因組比對，可以更容易地組裝基因組序列。

• 鳥槍法測序比需要遺傳圖譜的方法快得多且成本更低。

鳥槍法測序的缺點

• 需要大量的計算能力和複雜的軟體才能將鳥槍法序列組合在一起。

• 組裝錯誤更有可能發生，因為沒有使用遺傳圖譜。這些錯誤通常比其他方法更容易解決，並且如果可以使用參考基因組，則可以最大程度地減少這些錯誤。

• 只有在已經存在參考基因組的情況下才能真正進行全基因組鳥槍法測序，否則如果沒有現有的基因組進行匹配，組裝將非常困難。

• 全基因組鳥槍法測序也可能導致需要透過其他更勞動密集型的測序型別（例如克隆到克隆測序）來解決的錯誤。

• 重複基因組和序列可能更難以組裝。

結論

鳥槍法宏基因組測序使研究人員能夠全面取樣每個複雜樣本中所有存在的有機體中的所有基因。該方法使微生物學家能夠評估細菌多樣性和檢測各種環境中微生物的丰度。鳥槍法宏基因組學還提供了一種研究無法培養的微生物的方法，否則這些微生物難以或不可能進行分析。

透過能夠在單個測序執行中組合多個樣本並在每個樣本中獲得高序列覆蓋率，基於NGS的宏基因組測序可以檢測到使用其他方法可能錯過或成本過高的微生物群落的丰度非常低的成員。