非放射性同位素雜交法

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介紹

多年來，放射性同位素雜交技術一直被用於從混合分子中檢測DNA和RNA片段。但放射性同位素雜交技術更危險，因為它會啟用癌細胞並損害DNA，從而危害附近人員的健康。

因此，為了避免這個問題，人們一直在尋找更安全的替代方法，研究人員提出了一種相對較新的技術，其中酶標記探針與熒光底物反應生成有色產物。

非放射性雜交

非放射性同位素雜交法透過使用作用於化學發光或顯色底物的酶來幫助檢測目標DNA片段。這種底物被轉化為發光的產物。

這種方法相對安全，因為不使用放射性物質，因此不會產生有害輻射。

非放射性同位素雜交的型別

有兩種非放射性同位素雜交方法：

• 直接非放射性方法。

• 間接非放射性方法。

直接非放射性同位素方法

在這種方法中，反應混合物中加入了一種連線到標記基團的核苷酸。標記的基團稱為熒光團。熒光團是在暴露於特定波長的光時會發出熒光的基團。

一些常見的熒光團例子包括髮出紅色光的生物素，發出綠色光的熒光素，發出紅色光的羅丹明等等。

間接非放射性同位素方法

• 在這種方法中，報告分子透過化學鍵與核苷酸結合。標記的報告分子核苷酸自身附著到DNA上。標記分子附著在親和分子上，親和分子對報告分子具有非常高的特異性。結合的標記分子可以透過測定來檢測，然後新增到反應混合物中。

• 由於親和分子可以很容易地檢測到報告分子，它將與之結合。未結合的分子可以透過洗滌去除。通常使用的親和分子是抗體或特異性配體。

• 用於檢測標記分子的測定方法取決於附著在其上的基團。例如，如果使用特定的熒光染料，則可以使用熒光測定法進行檢測；如果酶附著在標記分子上，則使用比色法來識別最終形成的有色產物。

間接非放射性同位素方法的型別

根據所附著或結合的配體，有兩種間接系統：

• 生物素-鏈黴親和素系統

• 地高辛系統

生物素-鏈黴親和素系統

• 在這個系統中，兩種配體相互結合；一個是生物素，這是一種常見的維生素；另一個是鏈黴親和素或抗生物素蛋白。鏈黴親和素是一種細菌蛋白，抗生物素蛋白存在於蛋清中。

• 鏈黴親和素作為親和分子，對作為報告分子的生物素具有高度特異性。

• 首先，核苷酸與作為探針的生物素分子結合。然後將該探針與目標DNA片段雜交。

• 然後將鏈黴親和素新增到該混合物中，隨後新增與生物素結合的生物素標記酶（一種鹼性磷酸酶）。

• 然後新增標記酶的底物，並根據所使用的底物對酶促反應形成的產物進行測定。

• 鏈黴親和素具有四個生物素結合位點的獨特特性。因此，單個鏈黴親和素分子可以同時結合生物素標記探針和生物素標記酶。生物素標記或鏈黴親和素結合不會中斷酶的活性。

地高辛系統

• 地高辛來源於毛地黃植物，是由這種植物的花和葉產生的甾體。

• 地高辛結合到特異性抗體上，然後用於檢測目標核苷酸片段。

• 此處，與地高辛結合的抗體充當親和分子，而地高辛充當報告分子。

• 首先，核苷酸與地高辛結合，然後將該綴合物與DNA片段雜交。

• 然後加入親和分子（與地高辛結合的抗體）。現在，透過將鹼性磷酸酶與地高辛結合，形成地高辛標記酶。

• 加入底物後，根據所使用的底物，使用比色法或其他技術檢測形成的產物。

根據用於訊號放大的底物，非放射性同位素方法分為兩種型別

• 化學發光法：在這種方法中，使用化學發光底物，該底物在轉化為可使用發光計測量的特定產物後會發出光。

• 顯色法：在這種方法中，使用顯色底物，當合適的酶作用於它時，它會改變顏色。可以使用比色計測量這種顏色變化。

非放射性同位素雜交的優點

• 與放射性同位素方法相比，它們更靈敏。例如，化學發光法非常靈敏，並能產生準確的結果。

• 它們對環境的影響較小，因為不使用生物危害的放射性物質。它們易於處理，不需要特殊的方法。

• 這是一種非常快速的方法，因為可以在程式進行後的幾個小時內獲得結果。

• 探針更穩定。例如，生物素標記探針在室溫下可穩定儲存一年以上。

結論

儘管大多數研究實驗室都使用放射性同位素雜交技術，該技術涉及將目標DNA結合到固體支援物上，並使用放射性物質作為探針。但是，由於其危險性以及對複雜處置裝置的需求，它們已被使用環保底物和探針進行檢測的非放射性技術所取代。