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法學P1 衍生人工染色體或 PAC
關鍵詞
P1噬菌體、細菌人工染色體、細菌、DNA克隆載體、DNA片段、大腸桿菌、酵母人工染色體、複雜基因組、基因簇、限制性內切酶、連線、限制性位點。
介紹
P1 衍生人工染色體 (PAC) 是一種來源於 P1 噬菌體和細菌人工染色體的 DNA 結構。它可以攜帶約 100-300 千鹼基對的其他序列，用於細菌中的各種生物工程目的。
它是一種有效的克隆載體，用於克隆大腸桿菌細胞中的 DNA 片段（插入大小 100-300 kb；平均 150 kb）。DNA 克隆載體包含 P1 噬菌體基因組區域，能夠接受大型 DNA 插入片段（長 100 千鹼基對）。在這個系統中，載體 DNA 和待克隆的 DNA 片段體外連線幷包裝成噬菌體顆粒，這些噬菌體顆粒可以感染大腸桿菌。
PAC 可用於克隆大型基因、染色體步移、物理作圖和複雜基因組的鳥槍法測序。與細菌人工染色體 (BAC) 和酵母人工染色體 (YAC) 相比，PAC 克隆系統將有助於複雜基因組的作圖和詳細分析。
即使使用 BAC 和 PAC 載體，所需的基因簇有時也可能分佈在兩個或多個克隆之間。通常需要或希望將這兩個片段連線到一個單一的結構中，以便可以很容易地用於異源表達。由於缺乏合適的限制性位點，通常無法透過限制性內切酶消化和連線來實現這一點。
PAC 的歷史
P1 噬菌體最初由 Giuseppe Bertani 博士分離。在他的研究中，他注意到溶原菌產生了異常的非連續噬菌體，後來發現除了 P2 和 P3 噬菌體外，P1 噬菌體也是由 Lisbonne 溶原菌株產生的。
P1 可以複製細菌的宿主基因組並將該 DNA 資訊整合到其他細菌宿主中，也稱為普遍轉導。後來，P1 在 20 世紀 90 年代由 Nat Sternberg 及其同事開發為克隆載體。它能夠進行 Cre-Lox 重組。P1 載體系統最初是為在質粒中攜帶相對較大的 DNA 片段 (95-100kb) 而開發的。
構建
PAC 具有 2 個 loxP 位點，噬菌體重組酶可以在 Cre-Lox 重組過程中利用這些位點從其 cre 基因識別形成產物。此過程使 DNA 鏈環化，形成質粒，然後可以將其插入到諸如大腸桿菌之類的細菌中。
轉化通常透過電穿孔進行，電穿孔利用電力使質粒滲透到細胞中。如果需要高表達水平，則可以在構建體中使用 P1 裂解複製子。電穿孔允許 PAC 的溶原性，因此它們可以在不干擾其他染色體的情況下在細胞內複製。
與其他人工染色體的比較
PAC 是人工染色體載體之一。其他一些人工染色體包括細菌人工染色體、酵母人工染色體和人類人工染色體。與其他人工染色體相比，它可以攜帶相對較大的 DNA 片段，但比酵母人工染色體 (YAC) 要小。
與 YAC 相比，PAC 的一些優點包括：更容易操作細菌系統、更容易與 DNA 宿主分離、更高的轉化率、更穩定的插入片段，並且它們是非嵌合的，這意味著它們不會重排和連線形成新的 DNA 鏈，從而提供了一種使用者友好的載體選擇。
應用
PAC 通常用作大容量載體，允許在大腸桿菌中繁殖大型 DNA 插入片段。此功能通常用於：
- 構建人類、小鼠等的基因組文庫，有助於人類基因組計劃等專案。
- 文庫作為基因測序的模板（例如：用作小鼠基因功能分析中的基因模板）。
- 對更復雜生物體（植物、動物等）中不同基因的特定功能進行基因組分析。
- 促進基因表達。
由於 PAC 來源於噬菌體，因此 PAC 及其變體也可用於基於 PAC 的噬菌體療法和抗生素研究。
結論
細菌人工染色體 (BAC) 和 P1 衍生人工染色體 (PAC) 是穩定維持在細菌中的大型基因組克隆，由於其大小和穩定性，在透過轉染進行的功能研究中非常重要。因為大多數 BAC 或 PAC 載體不具有哺乳動物選擇標記，所以用 BAC 或 PAC 中克隆的基因轉染哺乳動物細胞需要將哺乳動物選擇標記插入 BAC/PAC 中。
大型基因組測序專案已經提供了許多基因的 DNA 序列資訊，但是大多數基因的生物學功能只有透過功能研究才能知道。然而，目前可用的程式在效率和保真度方面並不令人滿意。
BAC/PAC 改裝載體用於轉化成有能力的 BAC 或 PAC 菌株，將透過體內 cre/loxP 位點特異性重組催化其自身特異性插入 BAC/PAC 載體中。
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