微生物發酵：終產物的收穫、純化和回收

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關鍵詞

細胞裂解，細胞壁工程，下游加工，微生物發酵，形態工程，合成生物學。

介紹

微生物發酵是由微生物的生命活動引起的化學變化，不同的微生物引起不同的發酵併產生不同的發酵產物。微生物的發酵不僅僅是製作食物，而是現代大規模生產中的一個工業部門。

這強調了在生產有機飼料和生物肥料中發酵和關鍵菌株的遺傳改良的應用。微生物對釀酒的影響始於葡萄園，並貫穿發酵和葡萄酒的儲存或陳釀過程。在生物加工行業，發酵是一個培養微生物以產生產品的單元操作。

發酵完成後，以適合其預期用途的劑型收穫、純化和最終加工發酵產物稱為下游加工。下游是一個非常昂貴的微生物發酵過程。

它通常涉及複雜的裝置和工藝，以從微生物的細胞內和細胞外空間獲得所需的化學物質或材料。下游加工是指回收和純化發酵產生的產物所需的程式。在下游加工步驟中，主要為細胞的顆粒透過過濾、離心和絮凝從液體中分離出來。

下游加工步驟

下游過程涉及五個主要階段：將細胞與發酵液分離（固液分離）、分離不純產物（釋放細胞內產物）、濃縮、純化（色譜）和產品的最終加工（製劑）。發酵產生的產物可以是細胞內或細胞外的，也可以是耐熱或敏感的。因此，下游工藝的設計考慮了許多因素，以最低的成本獲得純淨的分離產物。

特定工藝的選擇取決於以下因素。

• 產物位置：細胞外/細胞內。
• 產物敏感性。
• 產物濃度或可能的產量。
• 產物的特性和用途。
• 可接受的純度標準。
• 可能的雜質。
• 工藝的經濟性和產品的市場價格。

預處理

發酵液含有微生物細胞、細胞碎片、可溶性和不溶性培養基成分以及活性產物。對發酵液進行預處理以改變培養基的粘度、生物質大小以及顆粒之間的相互作用。將合成聚合物、纖維素聚陽離子以及無機鹽作為絮凝劑新增到培養基中。這些試劑可導致單個細胞顆粒凝聚成大的絮狀物，從而有利於透過離心分離。當產物是細胞內的時，採用一些方法來裂解細胞以釋放細胞內產物。

分離

細胞內產物的細胞破壞後和細胞外產物不破壞細胞後的細胞透過離心或過濾分離。過濾保留大的顆粒作為濾餅，並允許液體透過過濾器。液體透過過濾介質的流動取決於過濾器的面積、過濾器的孔徑以及濾餅在過濾介質上形成的流動阻力。纖維素、玻璃、陶瓷、合成膜、合成纖維、織物、金屬等用作過濾介質。當過濾不是去除微生物的令人滿意的方法時，可以使用離心法。不同型別的離心機具有不同的轉速。

濃縮

微生物細胞分離後，使用不同的提取、蒸發和沉澱技術對培養基進行分餾或提取。

• 蒸發是一個簡單但耗能的過程，主要用於去除水分。降膜蒸發器、強制膜蒸發器、板式蒸發器和離心強制膜蒸發器通常用於濃縮溶劑。

• 在產品回收過程中，進行沉澱以一步富集和濃縮產品。

• 沉澱技術通常用於回收產品以及分離雜質。沉澱是透過外部試劑實現的，例如酸和鹼（改變pH值）；有機溶劑如冷凍丙酮、乙醇、甲醇（改變介電特性）；鹽如硫酸銨或硫酸鈉（回收蛋白質），非離子聚合物如聚乙二醇（PEG）、聚電解質和蛋白質結合染料。

• 萃取通常應用於大規模發酵，用於濃縮和純化。產物的溶液和極性在選擇萃取溶劑中起主要作用。

• 多級萃取或逆流萃取也以高萃取率應用。混合沉降器、色譜柱和離心萃取器通常用於萃取。用於萃取的溶劑價格昂貴。因此，所有溶劑都在萃取過程中回收和再迴圈。

純化

透過濃縮獲得的粗產品然後透過分級沉澱、結晶和色譜技術純化。

• 結晶特別用於回收酸、溶劑以及純化各種化合物。透過結晶獲得的晶體透過過濾分離，溶解在合適的溶劑中，然後重新結晶以確保去除所有雜質。

• 色譜技術通常用於分離和純化發酵產物。

• 組分分佈在固定相和流動相之間。固定相是用合適的溶劑平衡的均勻尺寸顆粒的填充柱，而流動相是在該填充柱中移動的溶劑。

• 待分離的混合物填充到色譜柱中，然後是流動相。吸附色譜、離子交換色譜、凝膠過濾色譜、親和色譜、反相色譜和高效液相色譜是常用的蛋白質和藥物純化技術。產品的純度透過紙層析和薄層層析不斷確認。

• 不同型別的紙層析用於檢查分離產物的純度，例如上行紙層析、下行紙層析和圓形紙層析。

製劑

抗生素、蛋白質和酶配製成溶液、懸浮液或乾粉。將硫酸銨鹽、山梨醇、甘油、PEG等穩定劑新增到這些製劑中。

• 根據劑型，在最終制劑中還新增其他不同的新增劑，例如稀釋劑、潤滑劑、懸浮劑、乳化劑、著色劑等。

• 乾燥是最重要的步驟，主要用於蛋白質產品。接觸式乾燥器（例如轉筒乾燥器）、對流式乾燥器（例如噴霧乾燥器、流化乾燥器）和輻射式乾燥器（冷凍乾燥器）通常用於乾燥最終產品。

• 抗生素以粉末或懸浮液的形式包裝在無菌小瓶中，用於腸胃外或口服使用。它們可以製成薄膜衣片。

• 在下游加工過程中乾燥期間以及過程結束時，需要對發酵產物進行估算。重量分析法、分光光度法、比重法、光密度法、填充細胞體積分數、總活菌數、細胞成分測量、計數室和色譜法是用於估算發酵產物的常用方法。

• 在工藝過程中和最終產品完成時進行發酵產品的質量控制。在下游加工過程中，各步驟的產品評價決定了單元操作的效率。

• 發酵產品的質量保證或質量控制測試包括無菌測試、熱原測試、毒性測試、過敏測試、微生物測定和致癌性測試。在上市銷售前，它必須滿足所有政府標準。

結論

經驗證的縮小規模模型可模擬和預測大規模操作，是減輕試點風險並隨後以更高效且更經濟的方式展示生物過程的有用工具。

許多用於實驗室規模分離生物和合成產品的基本技術是由化學家和生物學家發明的，而生物化學和化學工程師的職責是改進這些技術以實現更大的生產能力。

下游加工被視為生物化學工程的一個子領域，而生物化學工程本身又是化學工程的一個子領域。下游加工和分析生物分離都與生物產品的分離或純化有關，但目的不同。