什麼是cDNA文庫?
關鍵詞
互補DNA,轉錄組,mRNA,真核細胞,細菌細胞,基因組DNA。
簡介
cDNA文庫是由克隆的cDNA(互補DNA)片段插入到宿主細胞集合中構成,這些片段構成了生物體轉錄組的一部分,並作為“文庫”儲存。cDNA是由細胞核中完全轉錄的mRNA產生的,因此只包含生物體的表達基因。
在真核細胞中,成熟的mRNA已經進行了剪接,因此產生的cDNA缺乏內含子,並且可以在細菌細胞中輕鬆表達。cDNA文庫中的資訊是一種強大而有用的工具,因為基因產物很容易識別,並且文庫缺乏基因組DNA文庫中發現的增強子、內含子和其他調控元件的資訊。
cDNA文庫的原理
構建cDNA文庫,需要產生來自生物體mRNA序列的DNA複製,然後將其克隆。
術語cDNA指的是文庫中所有的DNA都與mRNA互補,並且是由mRNA的反轉錄產生的。
大多數真核DNA由重複序列組成,這些序列不會轉錄成mRNA,在cDNA文庫中,這些序列沒有被表示。
需要注意的是,原核生物和低等真核生物不含內含子,因此這些物種的cDNA製備通常是不必要的。
因此,cDNA文庫僅由高等真核生物建立。
為了構建cDNA文庫,細菌和噬菌體DNA都可以用作載體。
cDNA文庫構建
cDNA是由真核細胞的成熟mRNA利用逆轉錄酶產生的。在真核生物中,poly-(A)尾(由長序列的腺嘌呤核苷酸組成)將mRNA與tRNA和rRNA區分開來,因此可以用作逆轉錄的引物位點。這存在一個問題,即並非所有轉錄本,例如組蛋白的轉錄本,都編碼poly-A尾。
mRNA提取
首先,需要分離mRNA模板以建立cDNA文庫。由於mRNA只包含外顯子,因此應考慮分離的mRNA的完整性,以便仍能產生編碼的蛋白質。分離的mRNA的範圍應為500 bp至8 kb。可以使用寡聚dT核苷酸包被樹脂進行柱純化,並利用mRNA的特徵,例如具有poly-A尾,只有包含該特徵的mRNA序列才能結合。然後洗脫結合到柱上的所需mRNA。
cDNA構建
一旦mRNA純化,寡聚dT引物就會結合到RNA的poly-A尾上。引物需要啟動逆轉錄酶的DNA合成。這導致了RNA-DNA雜交體的產生,其中一條互補DNA單鏈與一條mRNA單鏈結合。然後加入DNA聚合酶I,切割的RNA充當引物。DNA聚合酶I可以識別並啟動用DNA核苷酸替換RNA核苷酸。然後使用限制性內切酶和DNA連線酶將序列克隆到細菌質粒中。然後選擇克隆的細菌,通常使用抗生素選擇。一旦選擇,就會建立細菌的菌株,這些菌株稍後可以生長和測序以編譯cDNA文庫。
cDNA文庫與基因組DNA文庫
cDNA文庫缺乏基因組DNA中發現的非編碼和調控元件。基因組DNA文庫提供了關於生物體更詳細的資訊,但生成和維護的資源更密集。
用途
當複製真核基因組時,通常使用cDNA文庫,因為資訊量減少了,從而消除了文庫中大量的非編碼區域。
cDNA文庫用於在原核生物中表達真核基因。原核生物的DNA中沒有內含子,因此不具有任何可以在轉錄過程中將其切除的酶。
cDNA文庫在反向遺傳學中最有用,在反向遺傳學中,額外的基因組資訊用處不大。cDNA文庫經常用於功能克隆,以根據編碼蛋白質的功能來識別基因。
在真核DNA中,表達文庫使用互補DNA(cDNA)構建,以幫助確保插入片段確實是基因。
優點
富含來自積極轉錄的基因的片段
內含子不會干擾克隆序列;如果目標是在細菌中建立真核蛋白質,內含子會帶來問題,因為大多數細菌沒有消除內含子的方法。
缺點
cDNA文庫的缺點是它只包含存在於成熟mRNA中的序列。
沒有內含子以及在轉錄過程中修飾的任何其他序列;未轉錄成RNA的序列,例如啟動子和增強子,也不存在於cDNA文庫中。
還需要記住,只有從分離RNA的組織中表達的某些基因序列構成cDNA文庫。
此外,在cDNA文庫中,特定DNA序列的頻率取決於給定組織中相應mRNA的丰度。
相反,在基因組DNA文庫中,幾乎所有基因都以相同的頻率存在。