DNA純度評估

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介紹

DNA純度是指不含任何蛋白質、RNA或其他任何汙染物的DNA。即使在DNA提取後，仍然會殘留一些雜質，可以使用某些化學物質或酶將其去除。此步驟確保DNA的直接和下游應用的成功。

DNA純化

使用各種物理和化學方法裂解細胞，以從細胞核中釋放DNA。DNA提取後，細胞碎片以蛋白質的形式附著在其上，可以使用蛋白酶去除，或者直接從不純的DNA樣品中過濾掉。

進一步純化是透過使用異丙醇或乙醇等醇類沉澱DNA來完成的。DNA溶於水，因此無法分離，因此使用乙醇攪拌DNA並使用無菌移液管將其纏繞出來。此後，DNA懸浮在鹼性溶液中並使用。

DNA純化的重要性

• 純化很重要，因為它確保提取了研究工作所需的相同質粒或基因組DNA。

• 去除DNA中的碎片或汙染物可以延長DNA的儲存期，並降低研究工作中出現錯誤的可能性。

DNA純度評估方法

一般使用三種方法來評估DNA的純度：

• 吸光度法

• 熒光法

• 凝膠電泳

使用分光光度法的吸光度法

• 這是測試DNA純度和產量的最可靠方法。吸光度法測定純度所需的裝置包括：具有紫外燈的分光光度計、對紫外光透明的比色皿以及待測DNA樣品。

• 由於DNA在260nm波長處強烈吸收光線，因此吸光度讀數取為260nm或A260。此波長產生的數值允許估計含有DNA溶液的濃度。

• 儀器中設定的線性範圍為0.1到1，用於獲得有用的數值。在320nm處測量DNA樣品的濁度。

• 樣品中DNA的濃度由以下公式給出：

DNA濃度(µg/ml) = (A260 - A320) × 稀釋因子 × 50µg/ml

• DNA的產量可以透過濃度和樣品體積的乘積來測量。

DNA產量(µg) = DNA濃度 × 樣品體積 (ml)

• 但是，這種計算存在侷限性，不僅DNA，RNA也能在260nm處吸收紫外光。一些芳香族氨基酸，如酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸，也能在280nm處吸收紫外光，而胍在260nm處也有很高的吸收。由於所有這些原因，有時產量會被高估。

• 為了克服這一侷限性，透過測試230nm到320nm的純度來測試雜質的存在。最常用的純度計算是透過取260nm與280nm的比率來完成的。純DNA的值為1.7到2.0。低於1.7的值表示存在其他汙染物。純度計算公式如下：

DNA純度 (A₂₆₀/A₂₈₀) = (A₂₆₀讀數 - A₃₂₀讀數) ÷ (A₂₈₀讀數 - A₃₂₀讀數)

• 純DNA的首選值為大於1.5，小於該值表示濁度。

熒光法

• 與吸光度法相比，熒光法被認為更靈敏，可用於非常低濃度的DNA樣品。

• 此方法使用熒光DNA結合染料和稱為熒光計的儀器來檢查DNA的純度。與分光光度法相比，這些染料可提供更準確的結果。

• 一些常用的DNA結合熒光染料包括Pico Green、Quantiflour和Hoechst雙苯並咪唑，它們特異性地結合到雙鏈DNA上。

• 所使用的熒光計只有一個帶有微孔板的試管，樣品可以在PCR管、比色皿中讀取，這使得它成為檢測樣品中DNA純度和濃度的最便捷方法之一。

• 根據所選擇的染料，設定激發和發射值，計算未知值的濃度並與已知值進行比較。

• 此方法的唯一侷限性是熒光化合物的猝滅和光漂白效應會改變訊號。

凝膠電泳

• 另一種用於測試濃度和純度的方法是瓊脂糖凝膠電泳。

• 此方法根據電荷和大小分離DNA。由於DNA帶負電荷，它將向帶正電的陽極移動，DNA分子越小，移動速度越快。

• 製備瓊脂糖凝膠的百分比也決定了可以用其分離的尺寸範圍。與以不同速率移動的RNA或蛋白質相比，形成的DNA條帶是清晰的。

• 可以透過將DNA條帶的強度與標準DNA進行比較來確定濃度，並使用嵌入染料溴化乙錠來觀察DNA。

結論

在研究中，在將分離的DNA樣品用於分析過程之前，質量指標顯示其質量和可用性。這裡的質量指標是DNA樣品的完整性和純度。純度在很大程度上決定了研究的成功；因此，DNA樣品應不含任何蛋白質等汙染物。